Analyse av enzymkinetikkdata#

I forrige laboratorieoppgave gjorde dere kinetikkmålinger på enzymet alkalisk fosfatase, som er vist nedenfor.

Hide code cell source 
import py3Dmol

d = py3Dmol.view(query="pdb:1ANJ")
d.setStyle({"cartoon": {"color": "spectrum"}})
d.show()

You appear to be running in JupyterLab (or JavaScript failed to load for some other reason). You need to install the 3dmol extension:
jupyter labextension install jupyterlab_3dmol

Du skal nå lære hvordan du kan plotte og analysere enzymkinetikkdata med Python. Først skal vi teste analyseprogrammet vi lager, med eksempeldata. Dette gjør vi for å sørge for at programmet fungerer som det skal, slik at eventuelle feil som dukker opp, antakelig kan tilskrives dataene du har samlet inn selv. Dette skal du gjøre som prelab.

Dersom du ønsker å friske opp Python-kunnskapene eller ikke har gjort mye Python-programmering før, kan du ta en kikk på nettsidene her, spesielt det som ligger under Biokjemi (KJM1140) i venstremenyen. Gjør gjerne underveisoppgavene på disse sidene hvis du er usikker på visualisering og regresjon med Python.

Du kan bruke en valgfri editor til å programmere i denne oppgaven, for eksempel Spyder eller Jupyter Notebook. Du kan også bruke de interaktive editorene (Trinket) som er bygd inn i denne sida.

Det er også noen spørsmål til oppgave 1 som må besvares i Canvas og leveres i løpet av labdagen (Oppgave 1, Lab 5 - Programmere analyse av kinetikkdata).

Prelab#

Del 1: Finne initialhastighetene#

Før vi kan begynne å analysere Michaelis-Menten- og Lineweaver-Burk-plottene, må vi finne initialhastigheten til reaksjonen som en funksjon av substratkonsentrasjonen fra dataene våre av absorbansøkning over tid.

Importere data#

Vi har lagret eksempelenzymkinetikkdata fra lab 4 i csv-filer, som du kan finne i Trinket-vinduet nedenfor eller på Canvas under “Filer lab 5”. CSV står for “comma-separated values”, altså er dataene separert med komma (eller semikolon). Dette må vi i visse tilfeller gi informasjon om til programmet vårt, så det er viktig å vite.

La oss se på hvordan vi kan lese av fila. Det finnes mange måter å importere filer på i Python. Du kan velge den metoden du er mest komfortabel med. Det enkleste metoden er å bruke read_csv fra pandas-biblioteket:

import pandas as pd

data = pd.read_csv("Absorbans_tid.csv") # Leser fila

tid = data["tid"]
absorbans = data["absorbans"]

Fila du skal lese av, må ligge i samme mappe som programmet som skal analysere og lese fila. Eventuelt kan vi angi filbanen, f.eks. “datafiler/Absorbans_tid.csv”. Vi kan også lese direkte fra internett. Da erstatter du filnavnet med en lenke.

Du skal snart få lese av en testfil, men først ser vi litt på hvordan vi kan utføre regresjon med Python.

Oppgave 1: Lineærtilpasning av dataene#

Lineær regresjon betyr å finne et polynom av første grad (en førstegradsfunksjon) som gir minst mulig gjennomsnittlig varians til et sett med datapunkter. Metodene vi skal bruke, benytter minste kvadraters metode for å estimere en slik funksjon. En funksjon som er ganske enkel å bruke til dette, er polyfit fra numpy-biblioteket. Du kjenner kanskje til og med denne funksjonen fra før (f.eks. fra IN-KJM1900). Denne funksjonen utfører polynomregresjon med en vilkårlig grad av polynomet.

Det polyfit-funksjonen derimot ikke kan estimere direkte, er andre typer regresjonsmodeller enn lineære, slik som eksponentialfunksjoner, logaritmefunksjoner eller logistiske funksjoner. Vi skal gjøre en logistisk regresjon seinere, og derfor benytter vi heller en annen funksjon som heter curve_fit fra scipy-biblioteket også når vi skal gjøre lineær regresjon i denne laben. Denne funksjonen returnerer både koeffisientene i regresjonslinja og et mål på hvor godt modellen passer dataene (såkalt kovarians). Det er koeffisientene a og b i uttrykket \(f(x) = ax + b\) som estimeres når vi gjør en linær regresjon.

I curve_fit må vi definere en funksjonsmodell på formen \(f(x, a, b, c, ...)\) som brukes som utgangspunkt for regresjonen. Her skal vi definere en funksjon \(f(x, a, b) = ax + b\).

Nå skal du gjøre en oppgavene/nivåene nedenfor. Velg kun én av nivåene. Dersom du mener du behersker enkel plotting og regresjon med curve_fit, velger du nivå 1. Dersom du er usikker på hvordan dette gjøres, kan du velge nivå 2. Prøv gjerne på nivå 1 før du prøver på nivå 2 - da lærer du enda mer! Du kan laste ned filene fra Canvas og bruke dem i en valgfri editor, som Jupyter Notebook, eller du kan kjøre koden i Trinket-vinduet nedenfor.

Les fila “Absorbans_tid.csv”. Definer en lineær modell som skal brukes i curve_fit-funksjonen og utfør en regresjon. Du kan bruke eksempelet på denne sida som starthjelp. Plott både datapunktene og modellfunksjonen du fikk fra regresjonen, i samme plott.

  1. Se på programmmet nedenfor og forklar hva det gjør, trinn for trinn.

  2. Skriv ut variabelen koeff og forklar hva den beskriver.

  3. Lag et plott av absorbans som funksjon av tid. Plott både datapunktene og regresjonslinja. Husk aksetitler og gjerne merkelapper (labels/legend).

import pandas as pd
import numpy as np
import scipy.optimize as opt

data = pd.read_csv("Absorbans_tid.csv")

tid = data["tid"]
absorbans = data["absorbans"]

# Definerer formen på modellen vi ønsker
def modell(x, a, b):
    return a*x + b

koeff, covar = opt.curve_fit(modell, tid, absorbans)
# Finner a og b her
a = koeff[0]
b = koeff[1]

# Beregner funksjonsverdier til den lineære tilpasningen
x = np.linspace(0,35,100) # Nye x-verdier å plotte med
y = a*x + b               # Regresjonsmodellens y-verdier

# Plott funksjonen her

Til levering i Canvas (oppgave 1): Skriv en forklaring på hva programmet gjør.

Oppgave 2: Håndtering av flere datafiler#

Du har nå et program som regner ut initialhastighetene for en bestemt substratkonsentrasjon. Men vi er interessert i å finne initialhastigheten som funksjon av substratkonsentrasjonen. Derfor vil vi gjøre samme prosedyre for alle de målte substratkonsentrasjonene. Vi gjentar dermed prosedyren ovenfor for flere filer med eksperimentelle data ved å bruke en løkke.

Denne oppgaven kan gjøre ved å følge prosedyren nedenfor, eller du kan klikke på “hint”-knappene for å få trinnvis hjelp til å løse oppgaven. Prøv å gjøre så mye som mulig selv. Du kan ta utgangspukt i programmet nedenfor, der vi har importert relevante biblioteker og lagd to lister med navn på datafilene og substratkonsentrasjonen i de ulike eksperimentene.

  1. Lag en lineær modellfunksjon som du skal bruke i kurvetilpasningen (se programmet du lagde/tolket i forrige oppgave).

  2. Lag et sett med tidsverdier som du skal plotte med, f.eks. verdier fra 0 til 35.

  3. Gå igjennom (iterer over) alle elementene i lista over filene. Hver fil skal leses, og det skal lages en modell (med curve_fit) for hvert eksperiment, altså for hver substratkonsentrasjon.

  4. Lag nye \(y\)-verdier med verdiene for \(V_0\) og \(I\), som du fikk fra modellen.

  5. Plott dataene og legg initialhastigheten i en liste.

  6. Lagre dataene og figuren. Dette kan du gjøre slik:

# plt.savefig("initialhastigheter.png")
plt.legend()
plt.show()

# Lagrer dataene i en dataframe og skriver dem til en csv-fil
d = {"Hastighet": V, "Substratkonsentrasjon": S}
df = pd.DataFrame(d)
df.to_csv("Reaksjonshastigheter.csv", index = False)

Hint 1: Modell og tidsverdier

Modellen defineres på samme måte som i forrige program, med en Python-funksjon som returnerer \(ax + b\). Tidsverdiene kan du lage med linspace-funksjonen fra numpy.

Hint 2: Løkke

Du kan konstruere en løkke som gjennomgår alle elementene i lista over filnavn, slik:

for i in range(len(dataliste)):
  data = pd.read_csv(dataliste[i]) # Leser fila

Løsningsforslag

import pandas as pd
import numpy as np
import matplotlib.pyplot as plt
import scipy.optimize as opt

dataliste = ['S40.csv' ,'S60.csv' ,'S120.csv' ,'S225.csv' , 'S900.csv']
S = [40,60,120,225,900] # Substratkonsentrasjoner i mikrogram/L

# Definerer formen på regresjonsmodellen
def modell(x, a, b):
    return a*x + b

t = np.linspace(0, 35, 100) # Nye x-verdier å plotte med
V = [] # Initialhastigheter

for i in range(len(dataliste)):
  data = pd.read_csv(dataliste[i]) # Leser fila
  koeff, covar = opt.curve_fit(modell, data["tid"], data["absorbans"])
  V0 = koeff[0]
  I = koeff[1]
  y = V0*t + I               # Regresjonsmodellens y-verdier
  plt.scatter(data["tid"], data["absorbans"], label = str(S[i])+" mg")
  plt.plot(t, y)
  plt.xlabel("Tid (min)")
  plt.ylabel("Absorbans")
  V.append(V0) #legger til funnet initialhastighet til liste

# plt.savefig("initialhastigheter.png")
plt.legend()
plt.show()

# Lagrer dataene i en dataframe og skriver dem til en csv-fil
d = {"Hastighet": V, "Substratkonsentrasjon": S}
df = pd.DataFrame(d)
df.to_csv("reaksjonshastigheter.csv", index = False)

Legg merke til at på slutten av en runde i løkka har vi lagt til den utregnde V0-verdien til en liste, V. I tillegg har vi puttet savefig(), legend() og show()-funksjonen utenfor løkka, slik at vi får alle grafene i ett plott. Funksjonen savefig() vil lagre figuren i mappen du kjører programmet i, dersom du kjører programmet lokalt på PC-en din, men du kan også bare høyreklikke figuren for å lagre den.

Oppgave

  1. Studer programmet ovenfor og forklar hva det gjør i store trekk. Kjør programmet og forklar hva figuren viser.

  2. Skriv ut initialhastighetene du fant. Hvordan fant du disse, og hva forteller de deg?

Til levering i Canvas (oppgave 2): Forklar hva programmet ditt gjør. Forklar også hvordan du fant initialhastighetene og hva de betyr.

Del 2: Finne vmaks og Km#

Oppgave 3: Michaelis-Menten#

Vi skal nå plotte og analysere resultatene fra del 1, altså skal vi lage et Michaelis-Menten-plott og tilpasse Michaelis-Menten likningen til verdiene vi fant for initialhastighetene. Vi har lagret substratkonsentrasjonene og de tilhørende initialhastighetene i en .csv-fil (reaksjonshastigheter.csv), og vi skal bruke denne fila videre.

Oppgave

  1. Les av fila som du lagde i forrige program, og skriv ut initialhastighetene og tilhørende substratkonsentrasjoner for å se at du har lest inn fila korrekt.

  2. Plott dataene (gjerne med scatter, slik at du får punkter istedenfor linjer) slik at du får et Michaelis-Menten-plott (husk hvilken form grafen skal ha!). Husk aksetitler med korrekte enheter.

  3. Forklar hva plottet sier deg.

Nå skal vi lage en modellkurve som er basert på Michaelis-Menten-likningen. Denne kan vi definere som en Python-funksjon, slik (på samme måte som du definerte den lineære funksjonen i del 1):

def michaelis_menten(x, Vmax, Km):
    return Vmax*x/(Km + x)

Oppgave

  1. Bruk funksjonen ovenfor og gjør en regresjon av initialhastighetene med curve_fit på samme måte som med den lineære funksjonen (men nå skal du bruke michaelis-menten-funksjonen som regresjonsmodell isteden).

  2. Plott regresjonskurven i samme koordinatsystem som dataene dine.

Til levering i Canvas (oppgave 3): Lever programmet ditt (som tekst på Canvas) som gjør regresjon og tilpasser en Michaelis-Menten-modell til dataene fra forrige oppgave

Oppgave 4: Lineweaver-Burk#

En alternativ modell for reaksjonshastigheter, er Lineweaver-Burk-modellen. For å lage en Lineweaver-Burk-representasjon av dataene våre, må vi ta de inverse (resiproke) verdiene av hastighetene og substratkonsentrasjonen. Dette kan vi gjøre på flere måter, men siden V og S er arrayer, kan du kanskje tenke deg en rask måte å finne 1/V og 1/S på?

Oppgave

Ettersom Lineweaver-Burk likningen er lineær, kan vi nå bruke en linær modell for kurvetilpasningen vår, slik som i del 1 av denne laben.

  1. Regn ut de inverse verdiene til V og S. Verdiene må ligge i ei liste eller en array.

  2. Inspiser de utregnede verdiene ved å printe dem ut.

  3. Gjør en lineær regresjon, som i del 1, av de inverse dataene (NB: Pass på at holder styr på hva som er x- og y-verdier).

  4. Fra Lineweaver-Burk modellen vet vi at skjæringspunktet tilsvarer 1/Vmaks og stigningstallet Km/Vmaks. Bruk dette til å regne ut \(V_{maks}\) og \(K_M\).

  5. Plott Lineweaver-Burk-tilpasningen med de inverse verdiene og beskriv hva plottet forteller deg. Legg inn en x- og y-akse med henholdsvis axhline(0) og axvline(0) (gjerne med svart farge), slik at det er tydeligere å tolke resultatene.

Til levering i Canvas (oppgave 4): Lim inn programmet ditt.

Oppgave 5: Enzymhemming#

For å avgjøre om en hemmer er ikke-konkurrerende eller konkurrerende, kan vi plotte en modell for initalhastigheter med og uten hemmer i samme koordinatsystem. Om du vil tegne flere enn ett Lineweaver-Burk-plott i samme figur, kan du gjøre som i del 1: lage en løkke som går igjennom flere filer med data, analysere og plotte dataene. Eventuelt kan vi lage en funksjon som plotter et Lineweaver-Burk-plott, slik at vi kan bruke denne på flere filer. Dette vil for eksempel være interessant dersom vi vil sammenlikne resultatene for et enzym med og uten hemmer. For å teste dette skal vi se på et annet sett med enzymkinetikkdata.

Prostaglandiner er en klasse fettsyrederivater som har en kraftig virkning på vevet til virveldyr. De gir feber, betennelse og tilhørende smerte. Prostaglandiner dannes fra fettsyren arkidonsyre i en reaksjon som katalyseres av enzymet prostaglandinendoperoksidsyntase. Dette enzymet er en syklooksygenase, og bruker oksygen til å omdanne arkidonsyre til prostaglandin G2 (PGG2), forløperen for mange prostaglandiner.

Følgende kinetikkforsøk er utført hvor hastigheten for dannelse av PGG2 er bestemt med og uten hemmeren ibuprofen tilstede. Ibuprofen er et virkestoff som blant annet finnes i IBUX, og fungerer som en hemmer av prostaglandinendoperoksidsyntase. Dette reduserer betennelse og smerte. Fila “Reaksjonshastigheter_orginal.csv” beskriver reaksjonen uten hemmer, og fila “Reaksjonshastigheter_ibuprofen.csv” beskriver reaksjonen med hemmer.

Oppgave

  1. Forklar hva programmet nedenfor gjør.

  2. Kjør programmet og forklar formen på grafen. Hva slags type hemmer er ibuprofen? [Svar i Canvas]

  3. Skriv ut verdiene for \(v_{maks}\) og \(K_m\). Hvilke verdier fikk du for Km og vmaks med og uten hemmer? [Svar i Canvas]

Til levering: Hva slags hemmer er ibuprofen? Begrunn svaret. Hvilke verdier fikk du for \(K_m\) og $v_{maks} med og uten hemmer?

Laboppgave (ikke gjør denne som prelab!) Analyse og rapport for laboratorieoppgave 4 – Enzymkinetikk#

Dere skal nå bruke programmene dere har utforsket, til å analysere og visualisere deres egne enzymkinetikkdata fra laboratorieoppgave 4. Du kan benytte Trinket-vinduet nedenfor for å utføre analysene, eller du kan bruke en annen editor, for eksempel Spyder eller Jupyter Notebook. Du bør bruke kode fra programmene som du har beskrevet og laget ovenfor til analysen. Du kan trykke på plusstegnet i Trinket-vinduet for å lage en fil. Kopier så data fra eksperimentene dine og lagre fila som en .csv-fil.

Forsøk 1: Bestemmelse av \(K_m\) og \(v_{maks}\) for alkalisk fosfatase fra E. coli#

Begynn med å lage inputfilene til programmet ditt. Du kan skrive dataene dine direkte inn i filen på .csv-format eller eksportere dem som .csv-filer fra eventuelle andre programmer du bruker for databehandling, som Excel. Dersom du eksporterte fra Logger Pro som CSV, vil filene dine allerede være på riktig format.

Fremstill initialhastigheten for de forskjellige prøvene uttrykt som absorbansøkning pr. min (= hastigheten) ved å plotte absorbansen som funksjon av tiden. Pass på at punktene du skal bruke for kurvetilpassing, fremdeles er i det lineære området. Gjør en lineærtilpasning for å finne initialhastighetene. Lag en figur som presenterer de eksperimentelle dataene og de tilhørende tilpasningene.

Lag deretter en visualisering av initialhastigheten som funksjon av substratkonsentrasjonen, som kan angis som mg PNPP (dinatriumsaltet) i 3,5 ml inkubasjonsblanding (mg/3,5 mL). Dette er Michaelis-Menten-plottet. Gjør en kurvetilpasning i Python for å finne \(v_{maks}\) og \(K_m\). Molekylvekten for dinatriumsaltet av p-nitrofenylfosfat heksahydrat settes lik 371,2 g/mol. Oppgi resultatet for \(K_m\) i mol/L.

Fremstill også resultatene i et Lineweaver-Burk-plott. Gjør også en lineærtilpasninger av datapunktene og finn \(v_{maks}\) og \(K_m\). Sammenlikn \(v_{maks}\) og \(K_m\) du får fra de to metodene. Husk å sette riktige enheter på alle verdier og grafer!

Forsøk 2. pH-optimum for den alkaliske fosfatasen#

I dette forsøket har du målt absorbansen kun ved start og slutt. Det betyr at du her ikke skal gjøre en kurvetilpassing for å beregne hastigheten, men istedenfor bruke differansen i absorbans og dividere med tiden. Husk å korrigere de siste avlesningsverdiene for fortynningen med Tris. Lag en grafisk fremstilling av reaksjonshastigheten som funksjon av pH.

Forsøk 3. Uorganisk fosfat som konkurrerende hemmer.#

Plott absorbansen som funksjon av tiden, og bestem initialhastighene for hvert forsøk, som i forsøk 1. Fremstill grafisk 1/v som funksjon av 1/S i et separat Lineweaver-Burk-diagram med aksedimensjoner tilpasset dette forsøket. Plott også inn deler av diagrammet fra den ikke-hemmede reaksjonen i forsøk 1. Finn \(K_m\) og \(v_{maks}\), og sammenlign med forsøk 1.

Rapport#

Dere skal levere inn en individuell rapport som skal inneholde:

  1. Introduksjon: En kort innledning for de fire delforsøkene hvor du skriver teori, bakgrunn og hensikten med forsøkene (ca. 1 side, maks 2)

  2. Metoder: Et kort felles sammendrag av metodene (ca. 1/2 side – for detaljert prosedyre henviser du til laboppgaveteksten).

  3. Resultater: En resultatdel som skal inneholde tabeller (med tabelltekst over tabellen) og grafer (med figurtekst under) av alle forsøkene.

  4. Diskusjon: En kort diskusjon/analyse av resultatene (dette vil vanligvis være lengste del av rapporten).

  5. Utregninger og rådata puttes i appendiks på slutten av rapporten

På Canvas ligger det en rapportmal som beskriver hvordan rapporten burde legges opp med lab 2+3 som eksempel og vurderingsmatrise som brukes for vurdering av rapportene. Dere har 2 forsøk på å få godkjent labrapport. Lever inn rapporten (1 per person) for lab 4 og 5 i Canvas senest en uke etter denne labøvelsen (lab 5).